قبل از آشنایی با ستون HPLC بهتر است اول با مفهوم HPLC آشنا شویم. آنالیز HPLC که مختصر شده عبارت High Performance Liquid Chromatography است در شیمی تحلیل با نام کروماتوگرافی مایع شناخته می‌شود و کارایی بالای تکنیکی دارد؛ که برای جداسازی، شناسایی و تعیین کمیت اجزا در مخلوط های مواد غذایی، شیمیایی، دارویی، بیولوژیکی و غیره که در محلول های مایع حل شده اند استفاده می شود.
۱ . پمپ (Pump)
۲ . مخازن حلال (Solvent tanks)
۳ . انژکتور(Injector)
۴ . ستون(Column)
۵ . آشکار ساز (Detector)
۶ . کنترل کننده(Controller)
۷ . گازگیر(Degasser)
HPLC، در علوم آزمایشگاهی و بالینی کاربرد دارد و یک روش کارآمد در صنعت داروسازی است. محصول تهیه شده درصد خلوص بالایی برخوردار است و درنتیجه محصولات خالص تولید می کند. طبق فارماکوپه اروپا، HPLC تنها در ۱۵.۵٪ از سنتزها استفاده می‌شود، در حالی که در فارماکوپه ایالات متحده این درصد به ۴۴٪ می‌رسد. این تفاوت عمدتاً به دلیل محدودیت‌های مالی و زمانی است، چرا که HPLC در مقیاس بزرگ می‌تواند بسیار هزینه‌بر باشد.
از کاربرد های دیگر HPLC میتوان به مشاهده گونه های مختلف در نمونه های جمع آوری شده گفت . هنگام کشف داده از نمونه در مورد هویت نمونه هم ها، نیاز به استفاده از راه حل های استاندارد است. HPLC روشی برای تأیید نتایج واکنش های سنتز هست؛ زیرا درصد خلوص در این نوع تحقیقات حیاتی است.
HPLC می تواند در پزشکی کمک کند زیرا شامل تجزیه و تحلیل دارو می باشد. اما امروزه HPLC در تجزیه و تحلیل مواد مغذی استفاده می شود، که بیشتر در تجزیه تحلیل ادرار و خون برای اکثر آنالیزهای پزشکی با HPLC استفاده می شود.
ستون HPLC یکی از اجزای اصلی دستگاه کروماتوگرافی است که نقش کلیدی در جداسازی ترکیبات شیمیایی دارد. طول این ستون‌ها معمولاً بین ۱۰ تا ۳۰ سانتی‌متر است و از جنس فولاد ضد زنگ یا استیل ساخته می‌شوند. برای بسته‌بندی ستون HPLC بهتر از یک ماده تک عنصری استفاده می‌شود که می‌تواند از پلیمر یا سیلیس با ذرات جامد تشکیل شده باشد. این دستگاه به همراه ستون‌های آن، در جداسازی محلول‌ها و ذرات کوچکتر به طور موثری عمل می‌کند.
ستون‌های HPLC از ماده سیلیس تولید می شود که فاز ثابت قطبی بیشتر از فاز متحرک بوده است و برای تأمین فاز متحرک هم موادی مثل کلروفرم، هگزان و متیلن کلرید کاربرد دارد. برای جدا کردن ترکیبات محلول، اصل قطبیت اجزای نمونه وارد عمل می‌شود. در این فرآیند، ترکیبات محلول نمونه که با فاز ثابت قطبی تعامل بیشتری دارند، جدا می‌شوند. به عبارت دیگر، ترکیبات با قطبیت بالاتر بیشتر با فاز ثابت قطبی تعامل کرده و در نتیجه، از سایر ترکیبات جدا می‌شوند.
کاربرد ستون HPLC فاز نرمال به مایع نرمال فاز قندها ، اولیگو ساکاریدها ، دارو ها ، داروهای قطبی ، گلیکان ها ، ویتامین های محلول در آب ، داروهای شیمی درمانی و غیره اشاره کرد .
ستون فاز معکوس در HPLC برخلاف ستون فاز عادی عمل می‌کند. در این نوع ستون‌های HPLC ، از هیدروکربن‌های پیوندی و سایر هیدروکربن‌های غیرقطبی به عنوان فاز ثابت استفاده می‌شود. در فرآیند جداسازی، قطبیت اجزای نمونه نقش اصلی را ایفا می‌کند. ترکیبات محلول که تعامل بیشتری با فاز متحرک دارند، از ستون جدا می‌شوند. بنابراین، اجزایی که کمتر با فاز ثابت غیرقطبی تعامل دارند، به راحتی جدا می‌شوند. این روش برای جداسازی ترکیبات بر اساس قطبیت و تعامل آن‌ها با فازهای ثابت و متحرک موثر است.
کاربرد ستون های HPLC مایع فاز معکوس در انواع دارو ها , ویتامین های محلول در چربی (K,E,D,A) ، ویتامین های محلول در آب (B1 ,B2 ,B3 ,B5 ,B6 , B12) ، آنتی بیوتیک ها ، ضد صرع ، اسید آمینه و در بسیاری اسید چرب ، پپتید ، پروتئین ، آنزیم ، DNA ، RNA ، نوکلئوتید ، افزودنی های غذایی ، افزودنی های پلیمر و غیره وجود دارد.
یکی از ستون‌های کروماتوگرافی HPLC ، ستون‌های کروماتوگرافی تبادل یونی هستند که برای جداسازی ترکیباتی که به سادگی یونیزه می‌شوند، استفاده می‌شود. فاز متحرک در این ستون‌ها معمولاً یک مایع قطبی مانند محلول آب و نمک است، در حالی که فاز ثابت یک ماده اسیدی یا قلیایی با بار مثبت یا منفی می‌باشد. برای جداسازی ذرات محلول، نیروی جاذب یونی بین فاز ثابت باردار و ذرات محلول برقرار می‌شود. این نیروهای یونی به جداسازی موثر ترکیبات کمک می‌کنند و اجازه می‌دهند ترکیبات با بارهای متفاوت از یکدیگر جدا شوند. این تکنیک برای تجزیه و تحلیل مواد یونیزه بسیار مفید است.
کاربرد ستون های HPLC مایع تعویض یونی کاربرد های بسیاری دارد که می توان در آمینو اسید ها ، پپتید ، پروتئین ، پورین ، پیریمیدین ، نوکلئوزید ، نوکلئوتید ، اولیگو نوکلئوتید ، DNA و RNA ، محصولات PCR و مونوساکارید ، دی ساکارید و غیره مشاهده کرد.
ستون HPLC ابگریز یا کروماتوگرافی آبگریز (HIC) یک روش راحت و ساده است و تفاوت ستون HPLC ابگریز با ستون HPLC فاز معکوس برای اتصال و دفع پروتئین های آبگریز است. این محصول آب گریز بدین صورت کار می کند که استفاده از فازهای متحرک آبی در HIC اختلال در ساختار پروتئین ایجاد کرده و منجر به فعالیت بهتر می شود و مولکول های زیستی با غلظت زیاد نمک به یک سطح آبگریز ضعیف جذب می شوند و با کاهش شیب نمک شسته می شوند . ستون کروماتوگرافی آبگریز یا HIC ، برای بهبود عالی فعالیت پروتئین ، بارش نمک را با دقت کروماتوگرافی ترکیب می کند.
از کاربردهای ستون های HPLC مایع تعویض آب گریز می توان RNA ریبوزومی ، پروتئین ، اجزای آنتی بادی ، آنتی بیوتیک ، آنزیم ها و غیره گفت.
ستون‌های افینیتی برای جداسازی نمونه‌های پروتئینی بسیار پرکاربرد، گزینش‌پذیر و مؤثر هستند. این تکنیک بر اساس اثرات متقابل منحصر به فرد بین یک مولکول هدف و یک لیگاند متصل به یک ماتریکس عمل می‌کند. در این روش، مولکول‌های هدف به لیگاندهای خاصی که به ماتریکس ستون متصل هستند، جذب می‌شوند. این فرآیند باعث جداسازی دقیق و کارآمد پروتئین‌های مورد نظر از سایر ترکیبات موجود در نمونه می‌شود. تکنیک افینیتی به دلیل دقت و انتخاب‌پذیری بالا، به طور گسترده‌ای در تحقیقات بیوشیمی و بیوتکنولوژی استفاده می‌شود.
کاربرد ستون های HPLC مایع تمایل کاربرد های بسیاری دارد که می توان درکربوهیدرات ها ، کاتکول آمین ، بیو مولکول ها ، پپتید ، پروتئین ، پروتئین های هیستیدین دار ، ایمونو گلوبولین ، پروتئین های شیر ، پروتئین های غشایی، تراتسفرین ، ریبونوکلئاز ، آنتی ژن ها ، آنتی بادی ها ، آنزیم ها و غیره مشاهده کرد.
برای خرید یک ستون HPLC مناسب، ابتدا باید انواع مختلف ستون‌ها را بشناسید. علاوه بر این، اطلاعاتی مانند قطر و طول داخلی ستون، اندازه منافذ و اندازه مهره‌ها نیز بسیار مهم هستند. انتخاب صحیح این ویژگی‌ها به کارایی و دقت جداسازی ترکیبات کمک می‌کند و برای کاربردهای خاص شما ضروری است. شناخت دقیق این مشخصات به شما کمک می‌کند تا ستونی را انتخاب کنید که بهترین عملکرد را برای نیازهای تحقیقاتی یا صنعتی شما ارائه دهد.
در خرید ستون های HPLC شناخت نوع ستون ها مانند ستون HPLC فاز عادی یا نرمال ، ستون HPLC فاز معکوس ، ستون HPLC تبادل یونی ، ستون های HPLC مایع آب گریز و مایع تمایلی است. نکته بعدی توجه به مواد تشکیل‌دهنده ستون HPLC است که این مواد تشکیل دهنده سیلیکا و پلیمرها نام برد و ستون‌های HPLC دارای انواع مختلفی از نظر طول و قطر داخلی است. این دو عامل تأثیر زیادی بر کارایی، حساسیت و سرعت آنالیز دستگاه HPLC دارند. برای انتخاب ستون کروماتوگرافی مناسب، ابتدا باید کاربرد مورد نظر خود را مشخص کنید. اگر به حساسیت بالا و یا حجم کم نمونه نیاز دارید، ستون‌های باریک و کوتاه بهترین گزینه هستند. همچنین، اگر به دنبال کاهش زمان تحلیل و مصرف کمتر حلال هستید، ستون‌های باریک و کوتاه مناسب‌تر خواهند بود. انتخاب صحیح این ستون‌ها به افزایش دقت و کارایی در نتایج آنالیز کمک می‌کند.
در خرید ستون های HPLC بهتر است به نکاتی از جمله نوع نمونه یعنی ترکیبات هدف ، قطبیت و وزن مولکولی ؛ و شرایط کاری pH، دما و فشار دقت می شود . برای انتخاب ستون مناسب کروماتوگرافی، نیاز است به اندازه مهره‌های موجود در فاز ثابت توجه کنید. این مهره‌ها عموماً در بازه‌ی 2-10 میکرومتر قرار دارند. مهره‌های کوچکتر ممکن است وضوح و کارایی بهتری داشته باشند، اما معمولاً فشار برگشتی را افزایش می‌دهند. در زمان خرید ستون HPLC، اندازه منافذ یک نکته حیاتی است. منافذ کوچکتر، سطح بیشتری از ذرات را در ستون به خود می‌کشند. این ویژگی باعث افزایش ماندگاری نمونه می‌شود و در نتیجه به بهبود عملکرد کروماتوگرافی کمک می‌کند.
در انتخاب ستون HPLC برای کاربردهای خاص، ملاحظاتی همچون سازگاری شیمیایی، تحمل فشار و پایداری دما بسیار حائز اهمیت هستند. اولین نکته در سازگاری شیمیایی است که باید اطمینان حاصل کرد که فاز متحرک مورد استفاده و نمونه‌های مورد تحلیل با ستون سازگاری دارند تا از تداخلات ناخواسته جلوگیری شود. دومین نکته تحمل فشار است؛ ستون انتخابی باید قادر باشد فشارهای سیستم HPLC را تحمل کند تا از خرابی و نقصان در طول زمان جلوگیری شود. در نهایت، پایداری دما نیز مهم است؛ برخی از ستون‌های HPLC برای کار در دماهای بالا طراحی شده‌اند تا امکان تحلیل نمونه‌های با شرایط خاص را فراهم کنند.
تولید کنندگان زیادی این محصول را تولید می‌کنند از مهم‌ترین و بزرگ‌ترین تولید کنندگان این محصول عبارت‌اند از Agilent Technologies، Waters Corporation، Thermo Fisher Scientific، سیگما آلدریچ (Sigma-Aldrich)، Phenomenex و … . برای خریداری این محصول با کیفیت بالا می‌توانید از طریق این لینک از فروشگاه ما خریداری کنید.
